Pilnīgs polimerāzes ķēdes reakcijas metodes apraksts

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir cilvēka DNS īsa posma vairāku kopiju izveide. Neliels daudzums fizioloģiskā materiāla ir nepieciešams pētījumiem un rezultātu iegūšanai: krēpās, asinīs, amnija šķidrumā, siekalās, urīnā utt.

Kas ir polimerāzes ķēdes reakcija?

PCR metodi izstrādāja amerikāņu zinātnieks Melisons, kurš 1998. gadā uzvarēja Nobela prēmiju. Aktīvi izmantots:

• ar agrīnu infekciju diagnozi, onkoloģiskām patoloģijām;
• tiesu ekspertīzē, lai izpētītu ļoti nelielu DNS daudzumu;
• veterinārmedicīnā, bioloģijā, molekulārajā ģenētikā;
• personīgai identifikācijai ar DNS;
• apstiprināt paternitāti;
• ekoloģijā, piemēram, sekojot produkta kvalitātei, antropoloģijā.

Kas ir parakstīts PCR?

Polimerāzes ķēdes reakcija infekcijas slimību diagnostikā ir viena no drošākajām metodēm, kas sniedz visprecīzāko un uzticamāko analīzi. Piemēram, hlamīdiju analīzes ticamība ir tuvu 100%. Visbiežāk šo diagnostisko pasākumu nosaka pacientiem, kuriem testa laikā ir grūtības noteikt konkrētu patogēnu.

PCR laboratorijas testu izmantošana:

1. Lai meklētu patogēnos organismus, kas izraisa urīna un dzimumorgānu infekciju, ir grūti noteikt, kad tiek izmantoti kultūraugi vai imunoloģijas metode.
2. HIV sākotnējai analīzei sākotnējā posmā ar pozitīvu, bet apšaubāmu sākotnējās analīzes rezultātu, piemēram, inficēto vecāku jaundzimušajiem.
3. Noteikt onkoloģisko patoloģiju agrīnā stadijā un individuāli koriģēt ārstēšanas shēmu pacientiem.
4. Agrīnai iedzimtu patoloģiju atklāšanai un iespējamai ārstēšanai. Tātad daudzi nākotnes vecāki pārbauda, ​​vai viņi ir ģenētisko slimību nesēji. Bērniem šī metode nosaka, vai ir iespējama saskare ar slimībām, kas ir mantojamas.

Arī šī metode tiek izmantota:

• augļa patoloģijas noteikšanai grūtniecības sākumā;
• pacientiem pirms orgānu transplantācijas operācijas - nepieciešams, lai noteiktu audu saderību
• atklāt bīstamos patogēnus donora asinīs;
• jaundzimušajiem, lai atklātu slēptās infekcijas;
• novērtēt pretvīrusu vai pretmikrobu terapijas rezultātus.

Kāpēc iet caur šo procedūru?

Tā kā PCR tiek uzskatīta par ļoti efektīvu diagnostikas metodi, kas dod gandrīz 100% rezultātu, šo procedūru izmanto:

1. Lai apstiprinātu vai izslēgtu diagnozi.
2. Lai ātri novērtētu ārstēšanas efektivitāti.
3. Daudzos gadījumos šī metode tiek uzskatīta par vienīgo iespējamo veidu, kā noteikt patoloģiju, ja citas bakterioloģiskas, viroloģiskas metodes ir izrādījušās bezjēdzīgas.
4. Vīrusi, izmantojot PCR procedūru, tiek atklāti tūlīt pēc infekcijas un pirms galveno simptomu rašanās.
5. Mikroorganismu agrīna atklāšana ļaus ātri ārstēt.

Turklāt PCR analīze ļaus ātri atklāt nelielu skaitu mikroorganismu dzīvos vai mirušos paraugos. Tāpēc šī metode tiek izmantota, lai meklētu specifisku patogēnu organismu, piemēram, tuberkulozes bacillus.

Turklāt izmanto PCR analīzi:

• noteikt DNS jutīgumu pret konkrētiem antibiotiku veidiem, kas ļaus pēc iespējas ātrāk sākt ārstēšanu;
• kontrolēt epidēmiju izplatīšanos;
• identificēt un izsekot jauniem mikrobu, patogēnu veidiem.

Galvenie PCR veidi

Standarta metode

PCR analīze tiek veikta, pamatojoties uz vairāku specifisku DNS fragmentu un RNS divkāršošanu, izmantojot primer fermentus. Pateicoties tam, pētnieks saņem nepieciešamo materiālu daudzumu.

Reālā laika PCR

Šāda veida pētījumos konkrētā fragmenta identificēšanas process sākas pēc katra cikla. Šāda veida pētījumi ļauj iegūt informāciju par vīrusu un mikroorganismu skaitu organismā, ti, veikt kvantitatīvu analīzi.

Reversie transkripcijas režīms no PCR

Šo analīzi izmanto, lai meklētu viendaļīgas RNS, lai turpmāk atklātu vīrusus, kuru ģenētiskais pamats ir RNS. Piemēram, tas ir C hepatīta vīruss, imūndeficīts utt. Veicot šo pētījumu, tiek izmantots īpašs enzīms, pateicoties tam, ka tiek veidota viena šķipsna DNS. Pēc tam sistēma atjauno otro DNS daļu un veic tradicionālo procedūru.

Norādes

PCR procedūru izmanto infekcijas slimību, dzemdniecības, uroloģijas, ginekoloģijas un nefroloģijas, pediatrijas un citu klīniku klīnikās. Visbiežāk izmantotās norādes par uzdevumu analīzi ir šādas:

• noteikt ģenētisko noviržu risku bērnam iedzimtu patoloģiju klātbūtnē;
• diagnosticēt abus vecākus, plānojot grūtniecību vai kad māte ir grūtā stāvoklī bērna pārvadāšanas laikā;
• ar grūtībām, kas saistītas ar neauglības cēloņu noteikšanu;
• ja ir aizdomas par seksuālām infekcijām akūtā stadijā vai pastāv risks, ka viņu pāreja uz hronisku stadiju;
• atklāt nezināmas izcelsmes iekaisuma procesu cēloņus;
• ar neaizsargātu gadījuma seksu;
• noteikt patogēno mikroorganismu jutību pret konkrētu narkotiku;
• iespējama latenta infekcija, lai atklātu patogēnus bez acīmredzamiem simptomiem;
• apstiprināt atveseļošanos no slimības, tas ir, retrospektīvu diagnozi.

PCR izmanto arī tad, ja ir nepieciešams precīzi identificēt šādus patogēnus kā: hepatīta vīrusus, cilvēka imūndeficītu, citomegalovīrusu, herpes simplex vīrusu, masaliņu vīrusu, papilomas vīrusu.

Tur šo metodi izmanto infekciju noteikšanai: infekcioza mononukleoze, ērču encefalīts, kandidoze, ko izraisa Candida sēnītes, dzimumorgānu infekcijas un tuberkuloze.

Ja kontrindikācijas un droša metode?

Tā kā šī procedūra tiek veikta bez jebkādas ietekmes uz ķermeni, un tiek izmantots tikai bioloģisks materiāls, kas tiek izmantots pētniecībai, nav kontrindikāciju, jo nav iespējamas briesmas organismam. Taču, piemēram, dzemdes kakla kanāla biomateriāla paraugu ņemšana netiek veikta pēc kolposkopijas. Piegādes uztriepes, skrāpējumi ir atļauti tikai 4-7 dienas pēc menstruāciju beigām un pilnīgas izplūdes pārtraukšanas.

Procedūras sagatavošanas iezīmes

Kā PCR analīzes paraugs, kurā tiek atklāts svešzemju patogēna DNS, tiek izmantots bioloģisks šķidrums vai audi. Testa vielas uzņemšana notiek asins paraugu ņemšanas veidā no vēnas, skrāpējot no deguna dobuma, balsenes, dzemdes kakla, urīnizvadkanāla. Pirms diagnostikas procedūras ārstam pacientam jāpaskaidro, kādi materiāli tiks ņemti:

• herpes infekciju analīzē mononukleoze analizē urīnu, kā arī uztriepi no rīkles;
• testējot hepatītu vai toksoplazmozi, asinis ņem no vēnas;
• lai diagnosticētu dažāda veida CNS bojājumus, tiek ņemts cerebrospinālais šķidrums;
• pulmonoloģijā PCR analīzes paraugi ir pleiras šķidrums un krēpas;
• ja tas veic pētījumu par intrauterīnām infekcijām grūtniecības laikā, amnija šķidrums, analīzei tiek izmantotas placentas šūnas.

Rezultāta uzticamība un precizitāte ir atkarīga no biomateriāla sterilitātes un lietošanas apstākļiem. Tā kā PĶR pētījumi ir ļoti jutīgi, jebkura lietotā viela var piesārņot rezultātus. Kompetentā sagatavošanās biomateriāla piegādei nav pacientam grūtības.

Tomēr ir vairāki ieteikumi:

• analizējot seksuāli transmisīvās infekcijas, ir nepieciešams izslēgt intīmas kontaktus trīs dienas pirms materiāla piegādes;
• 72 stundām jāpārtrauc jebkādu maksts preparātu lietošana;
• no iepriekšējās dienas vakara pētāmo platību higiēnu nevar veikt
• 3-4 stundas pirms parauga ņemšanas no urīnizvadkanāla jāizslēdz urinācija;
• mēnesi pirms testu veikšanas jums jāpārtrauc antibiotiku lietošana;
• pirms ēšanas un dzeršanas no rīta tukšā dūšā tiek ievadītas asinis;
• Pēc došanās tualetē rīta urīns tiek savākts sterilā traukā.

Kā ir PCR?

Veicot pētījumus īpašā reaktorā, noteikts cikls atkārtojas:

1. Pirmais solis. Denaturācija. Siekalas, asinis, ginekoloģiskie testi un citas vielas tiek ievietotas aplikatorā, kur materiāls tiek sakarsēts un DNS sadalās divās ķēdēs.
2. Otrais solis. Nedaudz atdzesēta viela, pievienojot tam īpašas sastāvdaļas, kas atpazīst nepieciešamās DTC molekulas daļas un piesaistās tai.
3. 3 solis. Pagarinājums Procesa laikā ir pabeigts patogēno organismu DTC fragments, veidojas tā kopija. Šis cikls tiek atkārtots, kas divkāršo specifiskā DNS fragmenta kopiju.

Pēc pāris stundām veidojas daudzas šī fragmenta kopijas, atklājas to klātbūtne paraugos. Tad rezultāti tiek salīdzināti ar dažādu patogēnu veidu datu bāzēm. Tas ļauj noteikt infekcijas veidu.

Dekodēšanas analīzes iezīmes?

Pētījuma galīgais rezultāts pacientam tiks dots vairākas dienas pēc bioloģiskās analīzes.

Kvalitatīvā analīze

Negatīvs rezultāts šajā gadījumā nozīmē, ka testā iesniegtajā šķidrumā netika konstatēts infekcijas izraisītājs. Pozitīvs rezultāts liecina par patogēnu vīrusu vai baktēriju noteikšanu bioloģiskajā paraugā. Ja rezultāts bija pozitīvs, bet tajā pašā laikā personai nav infekcijas aktivizācijas pazīmju, šādu ķermeņa stāvokli sauc par asimptomātisku veselīgu nesēju.

Visbiežāk tas tiek novērots, izmantojot biomateriālu vīrusu patoloģijās. Šādā gadījumā ārstēšana nav nepieciešama, bet nepieciešama pastāvīga medicīniskā uzraudzība. Tā kā šādos apstākļos pastāv varbūtība:

• vīrusa izplatīšanās no pārvadātāja uz veseliem cilvēkiem;
• procesa aktivizēšana un patoloģijas pāreja uz hronisku formu.

Kvantitatīvā analīze

Kvantitatīvo rezultātu nosaka speciālists īpaši konkrēta veida infekcijai. Pamatojoties uz iegūtajiem rezultātiem, ir iespējams novērtēt attīstības pakāpi, patoloģijas stadiju, kas ļauj pēc iespējas ātrāk noteikt ārstēšanu.